kcl – Übersetzung – Keybot-Wörterbuch

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An aliquot of 2 µl of this suspension was added to 23 µl of PCR mixture containing 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM of each deoxynucleoside triphosphate (dATP, dUTP, dGTP, and dCTP) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), various concentrations of the respective primers (Table 2), and 1.0 unit of Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA).
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All PCR assays were performed directly from bacterial suspensions obtained after the rapid DNA extraction method. An aliquot of 2 µl of this suspension was added to 23 µl of PCR mixture containing 50 mM KCl, 20 mM Tris-HCl (pH 8.4), 2.5 mM MgCl2, 0.2 mM of each deoxynucleoside triphosphate(dATP, dUTP, dGTP, and dCTP) (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA), various concentrations of the respective primers (Table 2), and 1.0 unit of Platinum Taq DNA polymerase (Invitrogen Inc., Carlsbad, CA).
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Cultures were incubated for 15 min. 5 ml of each culture were harvested by centrifugation (8,525 × g, 4°C, 10 min). Cells were washed twice with 1 ml of PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, stored anaerobically prior to use) and centrifuged (13,000 × g, 4°C, 10 min).
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Eine über Nacht kultivierte E. coli MG1655 Zellkultur wurde verwendet, um ein MOPS Minimalmedium (1:100) zu impfen. Die Kultur wurde solange unter aeroben Bedingungen gezüchtet, bis ein A600 von 0,4 erreicht war. Die Kultur wurde für Stressbehandlungen in drei 15ml-Kulturen aufgeteilt. Eine unbehandelte Kultur diente als Negativkontrolle. Den beiden verbleibenden Kulturen wurde jeweils entweder 0,79 mM Allicin (128µg ml-1) oder 1mM Diamid zugegeben. Die Kulturen wurden für 15 Min. inkubiert. 5 ml jeder Kultur wurden durch Zentrifugation (8.525 × g, 4°C, 10 Min.) geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 1ml PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, bis zur Verwendung anaerob gelagert) gewaschen und zentrifugiert (13,000 × g, 4°C, 10 Min). Die Zellen wurden in Lysepuffer (PBS mit 6 mM Guanidinium HCl, pH 7.4) resuspendiert, bevor sie bei 4°C durch Ultraschall (VialTweeter Ultraschallgerät, Hielscher GmbH, Deutschland) (3 × 1Min) aufgeschlossen wurden. Die Zelldebris wurde durch Zentrifugation (13000 × g, 4°C, 15 Min) pelletiert. Der Überstand wurde in einer 3,5ml-Küvette QS-Makro (10 mm) mit magnetischem Rührstab überführt und mit 1ml Lysepuffer gemischt. Extinktion der Proben wurden bei 412 nm mit einem Jasco V-650-Spektrophotometer (mit PSC-718 temperaturgesteuertem Küvettenhalter) bei Raumtemperatur überwacht. Es wurden 100µl einer 3 mM Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) Lösung zugegeben. Die Extinktion wurde überwacht bis die Sättigung erreicht wurde. Die Berechnung der Thiol-Konzentration wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε412 = 13,700 M-1 cm-1 für Thio-2-nitrobenzoesäure (TNB) durchgeführt. Die zellulären Thiol-Konzentrationen wurden basierend auf einem E. coli-Zellvolumen von 6,7 x 10-15 Liter und einer Zelldichte von A600 = 0,5 (äquivalent zu 1 × 108 ml-1 Zellkultur) berechnet. (Müller et al. 2016)
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