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Cultures were incubated for 15 min. 5 ml of each culture were harvested by centrifugation (8,525 × g, 4°C, 10 min). Cells were washed twice with 1 ml of PBS (137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7.4, stored anaerobically prior to use) and centrifuged (13,000 × g, 4°C, 10 min).
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Eine über Nacht kultivierte E. coli MG1655 Zellkultur wurde verwendet, um ein MOPS Minimalmedium (1:100) zu impfen. Die Kultur wurde solange unter aeroben Bedingungen gezüchtet, bis ein A600 von 0,4 erreicht war. Die Kultur wurde für Stressbehandlungen in drei 15ml-Kulturen aufgeteilt. Eine unbehandelte Kultur diente als Negativkontrolle. Den beiden verbleibenden Kulturen wurde jeweils entweder 0,79 mM Allicin (128µg ml-1) oder 1mM Diamid zugegeben. Die Kulturen wurden für 15 Min. inkubiert. 5 ml jeder Kultur wurden durch Zentrifugation (8.525 × g, 4°C, 10 Min.) geerntet. Die Zellen wurden zweimal mit 1ml PBS (137mM NaCl, 2,7mM KCl, 10mM Na2HPO4, 2 mM KH2PO4, pH 7,4, bis zur Verwendung anaerob gelagert) gewaschen und zentrifugiert (13,000 × g, 4°C, 10 Min). Die Zellen wurden in Lysepuffer (PBS mit 6 mM Guanidinium HCl, pH 7.4) resuspendiert, bevor sie bei 4°C durch Ultraschall (VialTweeter Ultraschallgerät, Hielscher GmbH, Deutschland) (3 × 1Min) aufgeschlossen wurden. Die Zelldebris wurde durch Zentrifugation (13000 × g, 4°C, 15 Min) pelletiert. Der Überstand wurde in einer 3,5ml-Küvette QS-Makro (10 mm) mit magnetischem Rührstab überführt und mit 1ml Lysepuffer gemischt. Extinktion der Proben wurden bei 412 nm mit einem Jasco V-650-Spektrophotometer (mit PSC-718 temperaturgesteuertem Küvettenhalter) bei Raumtemperatur überwacht. Es wurden 100µl einer 3 mM Dithiobis (2-Nitrobenzoesäure) Lösung zugegeben. Die Extinktion wurde überwacht bis die Sättigung erreicht wurde. Die Berechnung der Thiol-Konzentration wurde unter Verwendung des Extinktionskoeffizienten ε412 = 13,700 M-1 cm-1 für Thio-2-nitrobenzoesäure (TNB) durchgeführt. Die zellulären Thiol-Konzentrationen wurden basierend auf einem E. coli-Zellvolumen von 6,7 x 10-15 Liter und einer Zelldichte von A600 = 0,5 (äquivalent zu 1 × 108 ml-1 Zellkultur) berechnet. (Müller et al. 2016)
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