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Une épreuve sérologique par micro?immunofluorescence est effectuée à l'aide d'une trousse commerciale (Focus Diagnostics Inc./Bio Nuclear Diagnostics Inc., Toronto, Ontario) à laquelle s'ajoute une épreuve maison faisant appel à l'antigène L2 purifié. Une valeur réciproque du titre d'IgG supérieure ou égale à 256 ou une valeur réciproque du titre d'IgM supérieure ou égale à 16 semble indiquer une infection aiguë. Toutefois, les résultats de l'épreuve sérologique doivent être confirmés par PCR et par séquençage ou RFLP. Il est important de noter qu'on ne recommande pas, dans les lignes directrices de l'ASPC (2006), d'utiliser l'épreuve sérologique à des fins diagnostiques en l'absence de culture ou de TAAN en raison de problèmes de réactivité croisée et d'interprétation des résultats d'analyse.
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