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C. MEGA PCR for HIV-1 DNA.
C. MEGA-PCR für HIV-1 DNA.
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To answer the diagnostic question "is a child HIV-infected?", the different methodologic variants for direct virus detection play an important role. In the majority of cases, antigen test, RNA-PCR and, alternatively, qualitative DNA-PCR results are in agreement with each other.
Für die diagnostische Beurteilung (Fragestellung: ist ein Kind HIV-infiziert?) haben die verschiedenen Formen des direkten Virusnachweises das grösste Gewicht. In der Regel stimmen die Resultate von Antigentest, RNA-PCR und allenfalls qualitativer DNA-PCR überein. Bei positiven Resultaten von mindestens zwei dieser drei Tests kann die Anwesenheit von HIV-1 im untersuchten Material als gesichert gelten. Eine Bestätigung des positiven Befunds anhand eines umgehend neu entnommenen Untersuchungsmaterials ist jedoch unerlässlich, um eine Verwechslung auszuschliessen. Die Kombination von bestätigt positivem Antigentest und positiver DNA- oder RNA-PCR ermöglicht heute eine sichere Erfassung der pädiatrischen HIV-Infektion innerhalb der ersten Lebenswochen. So ist es möglich, infizierte Kinder einer frühzeitigen antiretroviralen Therapie zuzuführen.
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Simple calculation shows that, even at the highest achievable analytical PCR sensitivity of a single copy, millions of HIV-infected cells could conceivably still be present in the immune system despite a negative test result.
Auf dem Gebiet der HIV-Diagnostik zeigen einfache Berechnungen, dass auch bei der maximal erreichbaren analytischen Sensitivität der PCR von einer einzigen Kopie bei einem negativen Resultat dieser Untersuchung immer noch Millionen von HIV-infizierten Zellen im Immunsystem vorhanden sein können. Eine weitere wesentliche Steigerung der Sensitivität der DNA-PCR wurde durch unsere Entwicklung der sog. MEGA-PCR realisiert. Die analytische Detektionsgrenze dieser Methode liegt bei 2-4 Kopien von HIV-1 DNA in einer Probe von maximal 500 µg DNA. Verglichen mit 1 Kopie in 1 µg DNA bei der Standard-PCR bedeutet dies eine 125- bis 250-fache Steigerung der analytischen Sensitivität. Das Verfahren eignet sich zur Bestätigung von Infektionen mit sehr geringem Virusbefall bei Erwachsenen. Bei Kindern ist sie wegen der Schwierigkeit, grosse Blut-proben zu asservieren, von beschränktem praktischem Wert. Die Methode eignet sich auch zur Untersuchung von Gewebeproben.
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Simple calculation shows that, even at the highest achievable analytical PCR sensitivity of a single copy, millions of HIV-infected cells could conceivably still be present in the immune system despite a negative test result.
Auf dem Gebiet der HIV-Diagnostik zeigen einfache Berechnungen, dass auch bei der maximal erreichbaren analytischen Sensitivität der PCR von einer einzigen Kopie bei einem negativen Resultat dieser Untersuchung immer noch Millionen von HIV-infizierten Zellen im Immunsystem vorhanden sein können. Eine weitere wesentliche Steigerung der Sensitivität der DNA-PCR wurde durch unsere Entwicklung der sog. MEGA-PCR realisiert. Die analytische Detektionsgrenze dieser Methode liegt bei 2-4 Kopien von HIV-1 DNA in einer Probe von maximal 500 µg DNA. Verglichen mit 1 Kopie in 1 µg DNA bei der Standard-PCR bedeutet dies eine 125- bis 250-fache Steigerung der analytischen Sensitivität. Das Verfahren eignet sich zur Bestätigung von Infektionen mit sehr geringem Virusbefall bei Erwachsenen. Bei Kindern ist sie wegen der Schwierigkeit, grosse Blut-proben zu asservieren, von beschränktem praktischem Wert. Die Methode eignet sich auch zur Untersuchung von Gewebeproben.
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The sensitivity of the test is roughly equivalent to RNA-PCR (400 copies/mL) and is used to clarify cases of suspected HIV-infection not detectable with more traditional tests or in the case of suspected infection with an unknown retrovirus.
Dieser am NZR entwickelte Test ermöglicht den Nachweis und die Quantifizierung sämtlicher infektiöser Retroviren mittels des in den Viruspartikeln enthaltenen Enzyms Reverse Transcriptase. Der Test ist etwa gleich sensitiv wie die RNA-PCR (400 Kopien/mL) und wird in Fällen eingesetzt, in welchen eine Infektion mit einem durch die üblichen Tests nicht erfassbaren HIV oder einem noch unbekannten Retrovirus vermutet wird. Mögliche Untersuchungsmaterialien sind Plasma (–70°C), Liquor cerebrospinalis und andere Körperflüssigkeiten. Der PERT Assay kann auch zur Kontrolle biomedizinischer Produkte (Vakzinen, Gerinnungspräparate etc.) bezüglich Retrovirusfreiheit eingesetzt werden. Es können nur die Retrovirus-Partikel, nicht aber nichtexprimierte Proviren detektiert werden.
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Cultures are maintained for a maximum of four weeks. As the diagnostic sensitivity lies between 75 - 80%, use of virus culture is clearly inferior to PCR and antigen tests. Consequently, virus culture is only applied at the SNCR when looking for other retroviruses than HIV.
Das Untersuchungsmaterial wird in vitro kultiviert und die Kulturüberstände werden 2x wöchentlich mit dem PERT Assay untersucht. Bei Verdacht auf HIV-Infektion wird zusätzlich der HIV-1 p24 Antigentest eingesetzt. Ein positives Resultat erfordert, dass mindestens zwei unabhängig entnommene Ueberstände mit einem oder beiden dieser Tests positiv waren. Die Kulturen werden über maximal 4 Wochen geführt. Mit einer diagnostischen Sensitivität von 75-80% ist die HIV Viruskultur der PCR und dem Antigentest deutlich unterlegen. Am NZR wird sie deshalb nur noch durchgeführt, wenn nach einem anderen Retrovirus als HIV gesucht wird.
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This approach requires DNA isolated from mononuclear cells of the victim, the accused, as well as a number of other DNA samples derived from donors within the geographical environs of these two individuals. As with HIV-subtype determination, a 0.7 kb-long HIV fragment from the C2-V5 region of the HIV env gene is amplified and sequenced by means of "nested PCR".
Diese wird hauptsächlich im Rahmen forensischer Untersuchungen eingesetzt, wobei es um die Frage geht, ob jemand HIV auf eine Drittperson übertragen hat. Für die Untersuchung wird DNA aus den mononuklären Zellen des oder der Geschädigten, des Angeklagten sowie einer Reihe weiterer Kontrollen aus dem geographischen Umfeld der Probanden isoliert. Wie bei der HIV-Subtypenbestimmung wird ein 0,7 kb langes HIV Fragment aus der Region C2–V5 des HIV env Gens mittels "nested PCR" amplifiziert und sequenziert. Die Verwandtschaftsanalyse erfolgt unter Verwendung der Software Produkte Megaline, Clustal W oder PAUP und umfasst verschiedene Algorithmen.
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The detection limit of DNA-PCR carried out at the SNCR for all human retroviruses is in the vicinity of 1 copy/reaction. For HIV-1, the specificity of a positive result is 100% and the diagnostic sensitivity among HIV-positive adults is 96 - 98%.
Die Detektionsgrenze der am NZR durchgeführten DNA-PCR gegen alle menschlichen Retroviren liegt bei 1 Kopie/Reaktion. Für HIV-1 beträgt die Spezifität eines positiven Resultats 100%; die diagnostische Sensitivität in HIV-positiven Erwachsenen beträgt 96-98%. Bei pädiatrischen HIV-Infektionen (Kinder > 10 Tage) betrug die in einer prospektiven Studie erhobene diagnostische Sensitivität 100%. Für andere Retroviren kann wegen der in der Schweiz niedrigen Prävalenz bisher keine aussagekräftige Statistik erhoben werden.
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The detection limit of DNA-PCR carried out at the SNCR for all human retroviruses is in the vicinity of 1 copy/reaction. For HIV-1, the specificity of a positive result is 100% and the diagnostic sensitivity among HIV-positive adults is 96 - 98%.
Die Detektionsgrenze der am NZR durchgeführten DNA-PCR gegen alle menschlichen Retroviren liegt bei 1 Kopie/Reaktion. Für HIV-1 beträgt die Spezifität eines positiven Resultats 100%; die diagnostische Sensitivität in HIV-positiven Erwachsenen beträgt 96-98%. Bei pädiatrischen HIV-Infektionen (Kinder > 10 Tage) betrug die in einer prospektiven Studie erhobene diagnostische Sensitivität 100%. Für andere Retroviren kann wegen der in der Schweiz niedrigen Prävalenz bisher keine aussagekräftige Statistik erhoben werden.
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The results of individual tests can be either POSITIVE (POS), NEGATIVE (NEG), INDETERMINATE (IND) or, in the case of a test failure, NUL (0). With quantitative tests (virus load), a quantitative value is given at the same time. Test inaccuracy with quantitative PCR can be up to a factor of 3 i.e. half a log10.
Die Resultate der einzelnen Untersuchungen sind entweder POSITIV (POS), NEGATIV (NEG), INDETERMINAT (IND) oder, wenn ein Testversagen vorliegt, NULL (0). Bei quantitativen Untersuchungen (Virus Load) wird gleichzeitig ein Konzentrationswert angegeben. Die Messungenauigkeit bei quantitativer PCR kann bis einen Faktor 3 bzw. ein halbes log10 betragen.
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For this test, viral RNA is extracted from plasma. An area of the pol gene encoding both the reverse transcriptase and protease enzymes is reverse transcribed and amplified with PCR. The product is then analysed with PCR population sequencing.
Virale RNA wird aus dem Plasma extrahiert. Der Bereich des pol Gens, welcher für die Reverse Transcriptase und die Protease kodiert, wird revers transcriptiert und mit PCR amplifiziert. Das Produkt wird mit PCR Population Sequencing analysiert. Die ermittelte Sequenz wird mittels Internet-gestützten Algorithmen auf Mutationen untersucht, die mit Resistenz gegenüber antiretroviralen Medikamenten assoziiert sind. Der Untersuchungsbericht enthält eine Liste der vorgefundenen Resistenzmutationen sowie ein Rating des Virus bezüglich der Sensitivität gegenüber den gebräuchlichen antiretroviralen Medikamenten.
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For this test, viral RNA is extracted from plasma. An area of the pol gene encoding both the reverse transcriptase and protease enzymes is reverse transcribed and amplified with PCR. The product is then analysed with PCR population sequencing.
Virale RNA wird aus dem Plasma extrahiert. Der Bereich des pol Gens, welcher für die Reverse Transcriptase und die Protease kodiert, wird revers transcriptiert und mit PCR amplifiziert. Das Produkt wird mit PCR Population Sequencing analysiert. Die ermittelte Sequenz wird mittels Internet-gestützten Algorithmen auf Mutationen untersucht, die mit Resistenz gegenüber antiretroviralen Medikamenten assoziiert sind. Der Untersuchungsbericht enthält eine Liste der vorgefundenen Resistenzmutationen sowie ein Rating des Virus bezüglich der Sensitivität gegenüber den gebräuchlichen antiretroviralen Medikamenten.
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Simple calculation shows that, even at the highest achievable analytical PCR sensitivity of a single copy, millions of HIV-infected cells could conceivably still be present in the immune system despite a negative test result.
Auf dem Gebiet der HIV-Diagnostik zeigen einfache Berechnungen, dass auch bei der maximal erreichbaren analytischen Sensitivität der PCR von einer einzigen Kopie bei einem negativen Resultat dieser Untersuchung immer noch Millionen von HIV-infizierten Zellen im Immunsystem vorhanden sein können. Eine weitere wesentliche Steigerung der Sensitivität der DNA-PCR wurde durch unsere Entwicklung der sog. MEGA-PCR realisiert. Die analytische Detektionsgrenze dieser Methode liegt bei 2-4 Kopien von HIV-1 DNA in einer Probe von maximal 500 µg DNA. Verglichen mit 1 Kopie in 1 µg DNA bei der Standard-PCR bedeutet dies eine 125- bis 250-fache Steigerung der analytischen Sensitivität. Das Verfahren eignet sich zur Bestätigung von Infektionen mit sehr geringem Virusbefall bei Erwachsenen. Bei Kindern ist sie wegen der Schwierigkeit, grosse Blut-proben zu asservieren, von beschränktem praktischem Wert. Die Methode eignet sich auch zur Untersuchung von Gewebeproben.
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Furthermore, the SNCR has developed a MEGA-PCR for animal retroviruses. Of particular importance with regard to xenotransplantation, in which animal tissue/organs (particularly from pigs) are transplanted into humans, is the MEGA-PCR for PERV, the porcine endogenous retrovirus.
Eine MEGA-PCR wurde am NZR auch für den Nachweis tierischer Retroviren entwickelt. Wichtig im Zusammenhang mit der Xenotransplantation, bei welcher tierische Gewebe/Organe (insbesondere des Schweins) auf den Menschen transplantiert werden, ist die MEGA-PCR für PERV, das porzine endogene Retrovirus. Dieser Test wurde am NZR für die virologische Ueberwachung von xenotransplantierten Patienten und ihrer Kontaktpersonen im Rahmen künftiger klinischer Studien entwickelt.
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In the case of a positive Western Blot result according to SNCR criteria, a confirmed positive antigen test or a positive PCR result, infection with a specific virus in adults can be concluded, provided that the result has not been established based on an artifact (sample mixup or contamination).
Bei Erwachsenen ist ein nach den NZR-Kriterien positiver Western Blot, ein bestätigt positiver Antigentest oder eine positive PCR für die Diagnose einer Infektion mit dem jeweiligen Retrovirus ausreichend, vorausgesetzt, dass das Resultat nicht aufgrund eines Artefakts (Verwechslung oder Kontamination) zustande kam. Daher muss auch eine Gesamtinterpretation "INFEKTION SICHER NACHGEWIESEN" mit einem neu entnommenen und direkt an uns eingesandten Untersuchungsmaterial abgesichert werden.
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Mononuclear cells are isolated from EDTA-blood, DNA is extracted from the cells and an HIV-specific fragment located in the region C2-V5 of the HIV env gene is amplified using a "nested PCR". The virus subtype is determined using sequence analysis and comparison made with reference sequences belonging to a range of known subtypes (subtypes A-H, J, K of the group M, groups O and N) and circulating recombinant forms (CRF).
Aus EDTA-Blut werden die mononukleären Zellen isoliert, die DNA daraus extrahiert und ein 0.7 kb langes HIV-spezifisches Fragment aus der Region C2-V5 des HIV env Gens mittels "nested PCR" amplifiziert. Die Subtypenzuweisung erfolgt durch Sequenzanalyse und Vergleich mit Referenzsequenzen der verschiedenen bekannten Subtypen (Subtypen A-H, J, K der Gruppe M, Subtypen der Gruppen O und N) und zirkulierenden rekombinanten Formen (CRF).
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Should individual tests take a longer period of time (e.g. virus cultures), an intermediate report consisting of already completed results (e.g. serology, PCR) is sent out. The intermediate report does not include an overall interpretation.
Falls Untersuchungen längere Zeit benötigen (z.B. Viruskulturen), wird ein Zwischenbericht mit den bereits erhobenen Resultaten (Serologie, PCR) verschickt. Der Zwischenbericht enthält keine Gesamtinterpretation.
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For small children, a sample of 2 - 5 mL of EDTA-blood is appropriate. In the case of an expected low virus load, larger samples (e.g. 2 x 10 mL) should be sent in as a rule. For the MEGA-PCR, 4 x 10 mL of sample are required.
Bei Jugendlichen und Erwachsenen reichen 10 mL EDTA-Blut für alle Untersuchungen. Bei Kleinkindern sind 2-5 mL einzusenden. Für die MEGA-PCR werden 4x10 mL benötigt. Auch bei einem erwarteten niedrigen Virus Load sind generell grosse Proben (2 Vacutainer à 10 mL) einzusenden.
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Unlike DNA-PCR, RNA-PCR is used to detect either virus particles in various body fluids or intracellular viral RNA. The method developed at the SNCR guarantees a detection limit of 5 - 10 RNA copies. However, this approach is not suitable for diagnosing HTLV-1 and HTLV-2 as these infections are not normally associated with a viremia.
Im Unterschied zur DNA-PCR dient die RNA-PCR dem Nachweis von Viruspartikeln in den verschiedenen Körperflüssigkeiten oder von intrazellulärer viraler RNA. Die am NZR entwickelte Methode garantiert den Nachweis von 5-10 RNA-Kopien. Bei HTLV-1 und HTLV-2 ist dieser Test diagnostisch nicht sinnvoll, da diese Infektionen in der Regel nicht mit einer Virämie einhergehen.
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Unlike DNA-PCR, RNA-PCR is used to detect either virus particles in various body fluids or intracellular viral RNA. The method developed at the SNCR guarantees a detection limit of 5 - 10 RNA copies. However, this approach is not suitable for diagnosing HTLV-1 and HTLV-2 as these infections are not normally associated with a viremia.
Im Unterschied zur DNA-PCR dient die RNA-PCR dem Nachweis von Viruspartikeln in den verschiedenen Körperflüssigkeiten oder von intrazellulärer viraler RNA. Die am NZR entwickelte Methode garantiert den Nachweis von 5-10 RNA-Kopien. Bei HTLV-1 und HTLV-2 ist dieser Test diagnostisch nicht sinnvoll, da diese Infektionen in der Regel nicht mit einer Virämie einhergehen.
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A MEGA-PCR for the detection of lentiviruses in sheep and goats (SRLV, small ruminant lentiviruses) has also been developed for veterinary medicine purposes.
Für die Veterinärmedizin wurde eine MEGA-PCR für den Nachweis von Lentiviren von Schafen und Ziegen (SRLV, small ruminant lentiviruses) entwickelt.
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B. DNA-PCR (for HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2).
B. DNA-PCR (für HIV-1, HIV-2, HTLV-1, HTLV-2).
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For the verification of HIV-2, HTLV-1 and HTLV-2 infections, DNA-PCR is the method of choice.
Für die Bestätigung von Infektionen mit HIV-2, HTLV-1 und HTLV-2 ist die DNA-PCR die Methode der Wahl.
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SNCR publications regarding refinement of PCR tests:
NZR-Publikationen zur Weiterentwicklung und Anwendung von PCR-Tests :
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D. RNA-PCR for HIV-1, HIV-2 (HTLV-1, HTLV-2).
D. RNA-PCR für HIV-1, HIV-2 (HTLV-1, HTLV-2).
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Furthermore, the SNCR has developed a MEGA-PCR for animal retroviruses. Of particular importance with regard to xenotransplantation, in which animal tissue/organs (particularly from pigs) are transplanted into humans, is the MEGA-PCR for PERV, the porcine endogenous retrovirus.
Eine MEGA-PCR wurde am NZR auch für den Nachweis tierischer Retroviren entwickelt. Wichtig im Zusammenhang mit der Xenotransplantation, bei welcher tierische Gewebe/Organe (insbesondere des Schweins) auf den Menschen transplantiert werden, ist die MEGA-PCR für PERV, das porzine endogene Retrovirus. Dieser Test wurde am NZR für die virologische Ueberwachung von xenotransplantierten Patienten und ihrer Kontaktpersonen im Rahmen künftiger klinischer Studien entwickelt.
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Simple calculation shows that, even at the highest achievable analytical PCR sensitivity of a single copy, millions of HIV-infected cells could conceivably still be present in the immune system despite a negative test result.
Auf dem Gebiet der HIV-Diagnostik zeigen einfache Berechnungen, dass auch bei der maximal erreichbaren analytischen Sensitivität der PCR von einer einzigen Kopie bei einem negativen Resultat dieser Untersuchung immer noch Millionen von HIV-infizierten Zellen im Immunsystem vorhanden sein können. Eine weitere wesentliche Steigerung der Sensitivität der DNA-PCR wurde durch unsere Entwicklung der sog. MEGA-PCR realisiert. Die analytische Detektionsgrenze dieser Methode liegt bei 2-4 Kopien von HIV-1 DNA in einer Probe von maximal 500 µg DNA. Verglichen mit 1 Kopie in 1 µg DNA bei der Standard-PCR bedeutet dies eine 125- bis 250-fache Steigerung der analytischen Sensitivität. Das Verfahren eignet sich zur Bestätigung von Infektionen mit sehr geringem Virusbefall bei Erwachsenen. Bei Kindern ist sie wegen der Schwierigkeit, grosse Blut-proben zu asservieren, von beschränktem praktischem Wert. Die Methode eignet sich auch zur Untersuchung von Gewebeproben.
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In a retrospective study undertaken at the SNCR with HIV-1 infected adults at every stage of disease progression, test sensitivity using 50µL of plasma was 97.8% and was equivalent to a RNA-PCR with a detection limit of 400 copies/mL.
Positive Resultate von Antigentests, die zu diagnostischen Zwecken durchgeführt werden, werden durch einen Neutralisationstest bestätigt (>50% Neutralisation = positiv), wodurch eine praktisch 100%ige Spezifität erreicht wird. Die Sensitivität bei Verwendung von 50 µL Plasmaproben betrug in einer retrospektiven Studie an adulten HIV-1-Infizierten aller Stadien 97.8% und war der RNA PCR mit einer Detektionsgrenze von 400 Kopien/mL ebenbürtig. Auch bei pädiatrischen HIV-Infektionen ist das Verfahren diagnostisch ebenso sensitiv wie die PCR (100% diagnostische Sensitivität > 10 Tage.; 50% <10 Tage). Mit der konsequent durchgeführten Neutralisation wird zudem eine praktisch 100%ige Spezifität erreicht. Bei neugeborenen Kindern in der ersten Lebenswoche ist bei isoliertem positivem Resultat des Antigentests (bei gleichzeitig negativer DNA- und RNA-PCR) Vorsicht geboten; nicht-infektiöses p24 könnte in immunkomplexierter Form zusammen mit den IgG Antikörpern der Mutter transplazentar in das Kind transportiert oder durch Microtransfusionen, die nicht unbedingt zu einer Infektion führen müssen, in den klindlichen Kreislauf gelangt sein.
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To answer the diagnostic question "is a child HIV-infected?", the different methodologic variants for direct virus detection play an important role. In the majority of cases, antigen test, RNA-PCR and, alternatively, qualitative DNA-PCR results are in agreement with each other.
Für die diagnostische Beurteilung (Fragestellung: ist ein Kind HIV-infiziert?) haben die verschiedenen Formen des direkten Virusnachweises das grösste Gewicht. In der Regel stimmen die Resultate von Antigentest, RNA-PCR und allenfalls qualitativer DNA-PCR überein. Bei positiven Resultaten von mindestens zwei dieser drei Tests kann die Anwesenheit von HIV-1 im untersuchten Material als gesichert gelten. Eine Bestätigung des positiven Befunds anhand eines umgehend neu entnommenen Untersuchungsmaterials ist jedoch unerlässlich, um eine Verwechslung auszuschliessen. Die Kombination von bestätigt positivem Antigentest und positiver DNA- oder RNA-PCR ermöglicht heute eine sichere Erfassung der pädiatrischen HIV-Infektion innerhalb der ersten Lebenswochen. So ist es möglich, infizierte Kinder einer frühzeitigen antiretroviralen Therapie zuzuführen.
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To answer the diagnostic question "is a child HIV-infected?", the different methodologic variants for direct virus detection play an important role. In the majority of cases, antigen test, RNA-PCR and, alternatively, qualitative DNA-PCR results are in agreement with each other.
Für die diagnostische Beurteilung (Fragestellung: ist ein Kind HIV-infiziert?) haben die verschiedenen Formen des direkten Virusnachweises das grösste Gewicht. In der Regel stimmen die Resultate von Antigentest, RNA-PCR und allenfalls qualitativer DNA-PCR überein. Bei positiven Resultaten von mindestens zwei dieser drei Tests kann die Anwesenheit von HIV-1 im untersuchten Material als gesichert gelten. Eine Bestätigung des positiven Befunds anhand eines umgehend neu entnommenen Untersuchungsmaterials ist jedoch unerlässlich, um eine Verwechslung auszuschliessen. Die Kombination von bestätigt positivem Antigentest und positiver DNA- oder RNA-PCR ermöglicht heute eine sichere Erfassung der pädiatrischen HIV-Infektion innerhalb der ersten Lebenswochen. So ist es möglich, infizierte Kinder einer frühzeitigen antiretroviralen Therapie zuzuführen.
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